CAR-T生产工艺流程及优化考量（下）

4.  CART细胞结构

CAR结构包含

1. 抗体的单链可变区（scFv）
2. 非信号胞外区
3. 与scFv链接的铰链区
4. 跨膜区
5. T细胞受体胞内CD3ζ区
6. 共刺激因子结构域

四代CAR的发展

• 第一代CART诱导T细胞激活仅通过cd3ζ信号域激活
• 第二代CART中增加了共刺激结构域
• 第三代CART增加两个共刺激结构域
• 第四代CART增加酶、细胞因子和共刺激配体

5.  T细胞扩增

在CART细胞扩增过程中，细胞数量不断增加，培养基体积增大，必须通过更多或更大的组织培养瓶，这极大地复杂化了制造过程，并且它无法实现大规模的生产。

静态培养袋，允许较少的手动开放处理，管道连接可以使其在无菌条件下进行。

另一种方法 使用生物反应器，如Xuri细胞扩增系统和Wave生物反应器系统，利用灌注机制添加营养物质以及去除生长抑制物质，从而简化了制造过程。

6.  细胞因子刺激

细胞因子在工艺中使用，作为刺激信号，对于CART细胞质量，表型等产生重要影响。主要是γ链细胞因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用IL-2 或者IL-7,同时使用/或者不适用IL-15.

诺华Yescarta使用IL-2，但是IL-2会导致分化和耗竭的T细胞表型。IL-7/IL-15可以增强T细胞活化和增殖，二者联合使用可以增加未分化CART（TN，TSCM）的存活和维持。单独添加IL-15也会增加耗竭表型，及抗凋亡活性。

和IL-2和IL-15比较，IL-21可以增加CD62L表达，增加抗肿瘤活性。

7.  抑制特定的信号通路

主要靶向GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：

• GSK3β阻断T细胞分化，产生更多的TSCM

• mTOR inhibitor rapamycin增加CD62L表达

• 体外AKT抑制剂也表现出增加T细胞抗肿瘤活性

• PI3K抑制剂idelalisib，降低调节性T细胞，逆转肿瘤免疫耐受，增加低分化CART细胞数量

8. 冷冻保存

冷冻保存CART细胞长达90天，不影响细胞的活力。使用前37℃过夜，可以恢复CART细胞活力。