干货 | 细胞鉴定——成瘤性检查方法及法规解读

1. 新建细胞系/株以及新型细胞基质。

2. 某些传代细胞已证明在一定代次内不具有成瘤性，而超过一定代次则具有成瘤性（如Vero）。

3. 用于疫苗生产的细胞系/株应进行成瘤性检查，但当未经遗传修饰的二倍体细胞被证明无成瘤性后，可以不作为常规检查要求。

注：已证明具有成瘤性的传代细胞（如BHK21，CHO，C127等），或细胞类型属成瘤性细胞（如杂交瘤细胞等），用于生产治疗性产品时可以不再做成瘤性检查。

目前使用比较广泛的成瘤性检查方法有动物接种法（体内）和软琼脂克隆形成实验（体外）。其中，体内法为评价的标准，但对某些细胞而言，体外法的结果也可以作为细胞成瘤性检查的参考，尤其是低代次、在动物体内无成瘤性的传代细胞系。

将待检测细胞接种于皮下或者肌肉内注射。至少观察16周接种部位是否有进行性结节形成，对出现的结节开始消退的动物，应在观察期末处死。不能形成进行性结节的细胞，不视为具有成瘤性。通常用 HeLa 或 HeLa S3细胞或其他已知成瘤性细胞作阳性对照，且对照组至少设10只动物，试验才视为有效。在观察期末，处死所有动物，对注射部位及其他部位 (如心脏、肺、肝、脾、肾、脑及局部淋巴结)进行观察和组织病理学检查，判断是否有接种细胞增生，进一步判定接种细胞是否形成肿瘤或有转移瘤。

使用低熔点琼脂模拟细胞在体内的微环境培养细胞，通常使用其它已知具有成瘤性的细胞作为阳性对照，对照组与实验组同步操作。常规培养3周左右，培养过程中可视情况适当地补充细胞培养液，直到阳性组在显微镜下明显观察到大量细胞集落，培养终止。使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下观察并拍照记录。

欧洲EMA、美国FDA以及WHO针对干细胞、体细胞、成体干细胞、转基因细胞、基因治疗产品以及生产用动物细胞培养物等发布了多项指导原则。EMA在《人体细胞医疗产品的指导原则》中表示“如果可以预见细胞转化风险则应该展开成瘤性研究，重点检测其增殖能力以及染色体完整性”，在《干细胞医疗产品反思文件》中提到“多能干细胞和体干细胞都存在肿瘤形成风险，培养条件可能会严重影响干细胞的基因组的不稳定，延长细胞培养有助于评估成瘤性和染色体稳定性”。

FDA指导原则认为控制hESC衍生的细胞产品中未分化的ESC或其他细胞杂质水平是成瘤性风险评价的主要方面，采用细胞增殖测定法和软琼脂集落形成法测定恶性转化细胞，以检测最终产品中的杂质细胞是否超过了最小肿瘤产生剂量。FDA还重点讨论了临床前实验物种的选择和动物模型的预测能力，以评估植入细胞到达移植部位微环境中是否形成肿瘤，以及引起宿主细胞和植入细胞在各组织器官中发生肿瘤转化的风险。