干货 | 外源性DNA残留检测简介

外源性DNA属于生物制品工艺相关杂质，对其含量进行检测可以确认产品纯化工艺是否合理，即能否有效去除外源DNA残余；同时可确认产品中杂质含量是否符合标准要求，该检测值是生物制品质量控制的重要参数之一。

致癌性风险：现存的主要致癌机制是引入的显性致癌基因（如真核生物中广泛存在的ras基因），通过直接转化使得部分正常细胞分化为瘤性细胞。

免疫原性风险：细菌基因组富含的CpG组分和未甲基化修饰的序列会刺激非特异性免疫反应，增加免疫原性风险。

致突变性风险：哺乳动物细胞基因组中含有高拷贝数的转座子，可通过异位重排改变基因组从而致突变。

美国药典：规定成品中残留DNA不高于10 ng/剂、长度不大于200 bp；

欧洲药典：规定残留DNA不超过10 ng/剂，具体可接受限度需由权威机构批准。

荧光染色法

应用荧光染料picogreen与双链DNA结合形成复合物，在480 nm激发光、520 nm接收光下检测，在一定的DNA浓度范围及荧光染料过量的条件下荧光强度与DNA浓度成正比，根据荧光强度计算样本中DNA残留量。

该方法操作简单、成本低廉、无需纯化DNA；纯DNA条件下灵敏度为0.2 ng/ml，基质中单链DNA和RNA对检测影响较小，高浓度蛋白对检测有干扰，故疫苗类产品经方法学验证后是可以使用的，但不适用于高剂量的蛋白类制品；该方法对各类DNA具有通用性，无需对不同类型DNA设计特异性探针，但也因其特异性差易受环境中DNA污染。

定量PCR法

对外源性DNA设计特异性引物和荧光标记的探针，以反应体系中荧光数值反映特异性扩增产物量，当反应过程中荧光强度达到预设的阈值时，体系的PCR循环数与该体系所含有的起始DNA模板量的对数呈线性关系，依据DNA标准品测定样本中外源性DNA残留量。

该方法序列特异性强、灵敏度高（fg级）、重现性好，是中国药典、美国药典和欧洲药典均推荐的方法；靶标区域的选择、引物和探针的特异性、DNA标准品质量对方法的灵敏度和准确度有较大影响，需针对不同外源性DNA开发特异的检测体系和DNA标准品。

免疫阈值法

应用单链DNA结合蛋白捕获变性的单链DNA，然后用尿素酶标记的抗-DNA抗体与结合的DNA反应，以尿素酶水解尿素后溶液pH变化反应体系中DNA含量，经DNA标准品计算残留DNA含量。

该方法灵敏度高（1-3 pg），有标准化操作流程，但依赖单链DNA结合蛋白和抗-DNA单克隆抗体两种蛋白与DNA的结合，费用较高且需片段不小于600 bp。