干货 | qPCR 实验中关于 CT 值问题的详细攻略（上）

qPCR 实验在分析 C_T 时常常遇到这几类问题，比如：

• 复孔间重复性差，是否都和操作有关？

• 无模板阴性对照出现 C_T 值时，目的基因的 C_T 值是否还能用？

• C_T 值很大该怎么办？

今天就给大家分享下，在 qPCR 实验中遇到关于 C_T 值的常见问题时该如何解决。

复孔间重复性差一般会有以下两种情况：

（1）C_T 值很大，如 C_T ≥ 30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的 C_T 值差异较大。

解决方法：如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的 △C_T 值为 3 or 5 以上，那 C_T 值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的 C_T 值参与计算。

（2）C_T ＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。

解决办法：从以下几个方面进行问题的排查：① 加样准确度；② 移液器吸取液体的准确度；③ 定期校准 qPCR 仪。

① 加样准确度

• 避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH₂O 配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液 cDNA 添加 1 μL，可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍，添加 5 μL，使用 ddH₂O 补齐体系至 20 μL 即可。

• SYBR Green Mix、配置的混合体系需要混合均匀。从 -20 ℃ 冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在一起的 Mix 用移液器吹打混匀。

② 移液器吸取液体的准确度

• 移液器量程定期校准，校准周期为 1 年。

• 购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导致吸取量程不准确。

• 在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。

③ 定期校准 qPCR 仪

• 一般 qPCR 仪校准周期为一年。

  
  

未完待续...

转自：诺唯赞