干货 | qPCR 实验中关于 CT 值问题的详细攻略（下）

造成 C_T 值偏大的因素较多，主要分为以下两大类情况：

（1）相同体系，前期实验 C_T 值正常，本次实验，所有基因扩增 C_T 值皆偏大。

这种情况下，需要排查 RNA 是否存在降解。如何判定 RNA 是否存在降解呢？可通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

完整度好的 RNA 是有三条带的，以真核生物为例，三条带分别是 28s、18s、5s，且 28s 条带的亮度是 18s 的两倍，5s 最暗（下图左）。

如果 RNA 发生降解，会出现三条带的亮度发生变化，甚至不存在完整的三条带。如果 28s 几乎看不到了，整个泳道 Smear 严重，说明 RNA 的降解已经很严重了，此时 RNA 不建议用作后续的逆转录实验（下图右）。重新提取 RNA 重复实验。

（2）该基因第一次扩增，其 C_T 值偏大，而其余基因的 C_T 值正常。

这种情况下就需要判定是因为基因的扩增效率低导致的 C_T 值偏大，还是基因本身的表达量低造成的 C_T 值偏大。

如何判定是因为基因的扩增效率低导致的 C_T 值偏大，还是基因本身的表达量低造成的 C_T 值偏大呢？首先需要计算引物的扩增效率。

可将基因的扩增产物进行梯度稀释（至少三个梯度，且梯度之间的 △C_T 均一，防止因为操作原因导致标准曲线线性关系差，进而影响扩增效率的计算），同时进行 qPCR。将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。

关于引物扩增效率的计算，可参考下面的案例：

① qPCR 扩增：

将 qPCR 产物进行原液、1/10、1/100 梯度稀释，每个梯度设置三个复孔，进行 qPCR 扩增，复孔间 C_T 值取平均值，得到三组 C_T 值。

② 标准曲线绘制及扩增效率计算：

可以在 excel 上进行扩增效率的计算。稀释梯度可以设置为 -1、-2、-3，每个梯度对应的 CT 值分别为 23.69、27.04、30.27，如下图，进行标准曲线绘制。

通过标准曲线可以得到线性方程（y = -3.29 x + 20.42）与 R² 值（R² = 0.9999）。将线性方程得到的斜率（-3.29）带入扩增效率计算公式中：，即可得到扩增效率：101.35%。

只有当扩增效率满足 90~120%，且标准曲线 R² ≥ 0.99，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的 C_T 值才可以用来计算。且扩增效率越接近 100%，引物的扩增性能越优。

1. 若扩增效率不满足 90~120%，那 C_T 值偏大是因为扩增效率不达标导致的，需要重新设计引物。

2. 若引物的扩增效率满足 90~120% 前提下，C_T 值仍然很大，则是基因本身表达量低造成的 C_T 值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的方法是改为探针法进行定量。探针法的灵敏度是高于染料法的。

转自：诺唯赞